AAV基因治疗早期，基于同等剂量下对比AAV载体与第一代重组腺病毒（rAd）载体引起的免疫反应强度，人们判断AAV载体无明显免疫原性或免疫原性非常低。然而，首次给药AAV载体后，再次给药同种血清型AAV载体，会对再次给药的AAV载体产生较为强烈的免疫反应，表明第一次给药AAV，机体还是产生了针对AAV载体的明显的免疫反应（尽管相对腺病毒等载体免疫原性低），检测结果显示其中和（或结合）抗体由给药前的阴性转为阳性，表明AAV载体可以激活B细胞，产生针对AAV载体的中和（或结合）抗体；此外研究显示，免疫细胞可加工提呈AAV载体相关成分，激活特异性T细胞反应。影响AAV免疫反应的因素包括AAV载体的血清型、载体给药剂量、装载的治疗基因元件及其基因序列、给药途径、是否存在既往感染史，动物种属等。AAV基因治疗数据，尤其是临床试验数据提示AAV载体在低剂量给药时，免疫反应不强烈，但在高剂量给药时可能引起较为强烈的炎症免疫反应，对组织器官表现出毒性效应。此外，针对AAV载体及其治疗基因产物的免疫反应还会抑制其药效。当AAV载体进入人体细胞后，体内抗原提呈细胞（例如DC、巨噬细胞等）经模式识别受体（例如TLR9、TLR2等）检测识别到AAV载体上的病原体相关分子模式，激活下游的相关信号通路，活化NF-κB等转录因子，启动炎症因子表达，刺激抗原提呈细胞的成熟，上调MHC及其一些共刺激因子的表达。当抗原提呈细胞迁移至淋巴结后，将AAV载体抗原肽提呈给淋巴细胞，致敏抗原特异性T细胞，激活特异性免疫反应。早期由美国宾州大学主持进行的治疗血友病B的 AAV2 基因药物 I/II 期临床试验，证实AAV在人体内可引发严重的细胞免疫毒性反应, 高剂量给药组一名患者转氨酶水平急剧升高, 肝功能受到严重损害, 临床研究被迫终止。此研究中，患者经肝动脉输注装载人凝血因子Ⅸ基因的AAV2载体，分高中低三个剂量给药组，每组两位受试者。低中剂量给药组患者未出现明显毒副反应，但也未见药物疗效；高剂量给药组的两名患者中，一患者凝血因子Ⅸ水平在给药后两周内升至正常水平的3%，但在给药后第四周降至基线水平；另一位患者凝血因子Ⅸ水平升至正常水平的10%~12%，足以达到较好的疗效，但在给药后第四周，肝脏出现明显转氨酶升高。基于上述6位患者临床试验结果，将第 7 位患者的给药剂量降为中剂量, 也同样发生了转氨酶明显升高现象, 该临床研究随之终止。经排查未发现其他任何毒性或感染性因素, 也未检出针对转基因产物凝血因子Ⅸ的结合抗体。对第 7 位受试者的血液T 细胞研究显示, 上述毒性反应是针对AAV2 衣壳蛋白的细胞免疫反应，炎症因子IFN-γ的产生与AAV2 衣壳蛋白抗原肽直接相关。近期，X-连锁的肌管肌病(XLMTM)基因治疗（AT-132）临床试验（ASPIRO trial，NCT 03199469）中两名儿童死于药物副作用，据报道与高剂量AAV8载体衣壳引起的肝脏毒性有关，其肝毒性可能与针对AAV衣壳的免疫反应相关（详见公众号基因治疗领域往期文章《AAV载体高剂量给药的安全性问题浅析》）。此外，在AAV载体基因治疗其它临床试验中，接受高剂量全身给药AAV的患者中也出现了一些其他严重的不良事件（其严重程度不同）（见表1）。其副作用很大程度上是由于天然免疫反应(如炎症和补体激活)和特异性免疫反应所致。 一些临床前研究中也发现了AAV载体引发的炎症免疫毒性。前两年报道，研究人员对恒河猴与仔猪给予了高剂量AAV9（2X10^14vg/kg）,在恒河猴和仔猪中都引发了明显毒性。给药后3只恒河猴都出现明显的转氨酶升高。有两个转氨酶升高后消退，没有临床后遗症，而有一个发生急性肝衰竭和休克，并且在注射AAV载体后4天被安乐死。此外，还观察到背根神经节感觉神经元的退化，但临床表现较轻。仔猪没有表现出肝毒性，但在AAV载体注射后的14天内，所有三只仔猪表现出感觉功能缺陷和共济失调，其行动能力严重受损，不得不对其进行安乐死，提示可能在引起感觉神经元缺陷上，猪比恒河猴更加严重。上述报道的炎症毒性反应可能与补体系统激活有关。随后，在一些患者中也观察到与上述动物实验中类似的炎症毒性。尽管眼睛与中枢神经系统常被认为是免疫豁免部位，但有研究结果显示AAV载体直接给药眼部或中枢神经系统，仍会激发机体的炎症免疫反应。AAV被用于眼部基因治疗，其主要靶标是感光细胞（视锥细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮细胞（RPE）。尽管针对Leber先天性黑眼病2（LCA2）和脉络膜血红素等眼部疾病的临床试验已证明AAV基因疗法对人类安全，但无论大小动物模型，已发现AAV引起的眼毒性病例，具体情况取决于研究中使用的病毒载体元件或给药剂量：视网膜下注射AAV2- CNGA3显着导致绵羊中感光细胞和RPE的丧失以及淋巴细胞浸润，而注射AAV8- CNGA3则可以激活非人类灵长类动物的固有免疫反应和适应性免疫反应。去年的一篇报道称在小鼠模型中发现AAV载体中顺式调控序列与AAV诱导的毒性之间存在密切关系，此研究结果可以为基因治疗设计更安全的AAV载体；进一步分析发现AAV诱导的毒性与小胶质细胞活化和促炎细胞因子的增加有关。去年10月，诺华（Novartis）发布消息称美国FDA部分暂停了AVXS-101鞘内给药（intrathecal）的临床试验。诺华旗下的AveXis与卫生监管部门、临床试验研究者沟通了一项小型临床前研究的结果，在该研究中动物实验结果显示背根神经节 (DRG) 单核细胞炎症，有时伴有神经元胞体变性或丢失。此外，一些报道称，大剂量鞘内给药恒河猴后，脊髓背根神经节出现神经炎症综合征。另一项研究通过颅内直接给药AAVrh8，在食蟹猴上出现了明显的神经毒性（也有可能与其编码的目的蛋白过表达有关），尽管之前的研究结果表明在鼠、猫及羊等动物中进行的颅内注射AAVrh8载体药物，表现出了足够的安全性，表明AAV载体基因治疗在不同物种间的差异。表2列举了一些针对AAV载体的炎症免疫类别，与其对应的相关给药信息及应对策略。
上述AAV基因治疗临床前及临床试验中，出现的或重或轻的炎症免疫相关的副作用，提醒人们AAV载体在高剂量临床给药时需慎之又慎，AAV载体临床前动物实验毒理结果与人体临床试验可能存在明显差异。在AAV基因治疗领域，无疑需要通过进一步的研究（包括了解其机制）来解决上述毒性问题， 只有在对AAV高剂量毒性的机制有了更深入的了解后，才能为解决上述毒性问题设计出最佳的解决方案，使得AAV基因治疗安全性得到最充分的保障。尽管存在上述高剂量给药安全性问题，但众多的临床前试验及临床试验数据表明AAV载体无疑是高安全性的载体之一。（微信公众号“基因治疗领域”后续将继续在基因治疗的安全性方面做系列专题，近期将分别围绕AAV载体给药引起的固有免疫与适应性免疫展开深入综述，敬请留意。） 1. Flotte, Terence R. "Revisiting the “New” Inflammatory Toxicities of Adeno-Associated Virus Vectors." (2020): 398-399.2. Perez, Barbara A., et al. "Management of neuroinflammatory responses to AAV-mediated gene therapies for neurodegenerative diseases." Brain Sciences 10.2 (2020): 119.3. Novartis Announces AVXS-101 Intrathecal Study Update. Available online: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-announces-avxs-101-intrathecal-study-update (accessed on 28 January 2020).4. Rabinowitz, Joseph, Ying Kai Chan, and Richard Jude Samulski. "Adeno-associated virus (AAV) versus immune response." Viruses 11.2 (2019): 102.5. Le Bras, Alexandra. "A look at AAV toxicity in the mouse." Lab animal 48.5 (2019): 142-142.6. Barnes, Christopher, Olivia Scheideler, and David Schaffer. "Engineering the AAV capsid to evade immune responses." Current opinion in biotechnology 60 (2019): 99-103.7. Hordeaux, Juliette, et al. "Toxicology study of intra-cisterna magna adeno-associated virus 9 expressing human alpha-L-iduronidase in rhesus macaques." Molecular Therapy-Methods & Clinical Development 10 (2018): 79-88.8. Hinderer, Christian, et al. "Severe toxicity in nonhuman primates and piglets following high-dose intravenous administration of an adeno-associated virus vector expressing human SMN." Human gene therapy 29.3 (2018): 285-298.9. Golebiowski, Diane, et al. "Direct intracranial injection of AAVrh8 encoding monkey β-N-acetylhexosaminidase causes neurotoxicity in the primate brain." Human gene therapy 28.6 (2017): 510-522.10. Corti, Manuela, et al. "Safety of intradiaphragmatic delivery of adeno-associated virus-mediated alpha-glucosidase (rAAV1-CMV-hGAA) gene therapy in children affected by Pompe disease." Human Gene Therapy Clinical Development 28.4 (2017): 208-218.11. Rogers, Geoffrey L., et al. "Unique roles of TLR9-and MyD88-dependent and-independent pathways in adaptive immune responses to AAV-mediated gene transfer." Journal of innate immunity 7.3 (2015): 302-314.12. 刁勇, et al. "重组腺相关病毒基因药物的细胞免疫毒性及对策." 药学学报 9 (2010): 1071-1077.13. Manno, Catherine S., et al. "Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-Factor IX and limitations imposed by the host immune response." Nature medicine 12.3 (2006): 342-347.